ELISA實驗方法：ELISA中必要的三個試劑

在臨床檢驗中一般采用商品試劑盒進行測定，ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物等。

完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：

(1)已包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑);

(2)酶標記的抗原或抗體(結合物);

(3)酶的底物;

(4)陰性對照品和陽性對照品(定性測定中)，參考標準品和控制血清(定量測定中);

(5)酶聯(lián)物(結合物)及標本的稀釋液;

(6)洗滌液;

(7)酶反應終止液。

免疫吸附劑

已包被抗原或抗體的固相載體在低溫(2~8℃)干燥的條件下一般可保存6個月以上。有些不完整的試盒，僅供應包被用抗原或抗體，檢測人員需自行包被。以下簡述固相載體和包被過程。

固相載體

固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應。可作ELISA中載體的材料很多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。

ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板zui為常用，于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，上標準的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結果。現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標準化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時空白值較大。

良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG(一般為10ng/ml)包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內(nèi)加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應后，分別測每孔溶液的吸光度。控制反應條件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計算全部讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應小于10%。

與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點為質(zhì)軟板薄，可剪割，價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應用如下的試驗：用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本，將它們進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進行測定，然后比較結果。在哪一種載體上陽性結果與陰性結果差別zui大，這種載體就是這一ELISA測定項目的zui合適的固相載體。

在ELISA中，用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸附面積約為200mm2，小珠均為1000mm2，將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結合位點的暴露面處于*反應狀態(tài)，因此珠式ELISA的反應往往更為靈敏。小珠的另一特點是更易于使洗滌*，使用特殊的洗滌器，使小珠在洗滌過程中滾動淋洗，其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。